Karlov univerzitet u Pragu (češ. Univerzita Karlova v Praze; lat. Universitas Carolina) je jedan od najstarijih evropskih univerziteta, najstariji u Centralnoj Evropi, i prvi u slovenskim zemljama. Istorijski, to je i prvi nemački univerzitet.
Univerzitet je 7. aprila 1348. utemeljio Karlo IV, car Svetog rimskog carstva. Tada je on izdao bulu kojom je garantovao privilegije univerzitetu. Po nekima bula pape Klementa VI od 26. januara 1347. ima prvenstvo, i označava datum osnivanja. U početku, univerzitet je bio podeljen na sekcije ili „nacije“: bavarsku, češku, saksonsku i poljsku. Godine 1407. univerzitet je osudio teoriju teologa Džona Viklifa. Njegova doktrina je, ipak, dobijala na popularnosti. Rektor Karlovog univerziteta Jan Hus preveo je Viklifov „Trijalog“ na češki. Zbog sukoba sa Husom, nemački profesori su 1409. prešli u Lajpcig gde su osnovali univerzitet. Time je univerzitet ostao bez većine profesora i studenata, i tako je postao institucija manjeg, regionalnog značaja.
Početkom 17. veka dominantan uticaj na univerzitetu preuzimaju jezuiti. Godine 1784. nemački jezik postaje jezik nastave umesto latinskog. U isto vreme dopušteno je da studije pohađaju protestanti i jevreji. Predavanja o češkom jeziku i književnosti su počela 1793. Univerzitet je podeljen na nemački i češki univerzitet 1882. Ova dva univerziteta su paralelno koristila neke od zgrada. Neki od znamenitih studenata nemačkog univerziteta bili su: Ernst Mah, Albert Ajnštajn i Franc Kafka, dok su na češkom univerzitetu studirali: Karel Čapek i Edvard Beneš. Jedan semestar ovde je studirao Nikola Tesla. Međuratni period bio je period gloženja između češkog i nemačkog univerziteta. Posle Drugog svetskog rata preostalo osoblje nemačkog univerziteta preselilo se u Minhen.
Danas je Karlov univerzitet vodeći univerzitet u Češkoj. Sastoji se iz 17 fakulteta sa sedištem u Pragu, 2 sa sedištem u gradu Hradec Kralove i jedan u Plzenju.
